高效液相色谱法测定兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱的浓度
关于美国branson超声波振荡仪应用于高效液相法测定特定成分浓度的简述：喜树碱(camptothecin,CPT)是从植物喜树的树干、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱，由于毒性大而限制其临床应用。10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜树碱的半合成衍生物，体外和动物实验显示它比CPT的抗肿瘤作用强和抗瘤谱宽且毒性较低。本研究通过纳米技术将HCPT纳米针静脉注射到家兔体内，然后研究家兔血浆**浓度随时间变化规律方面考察HCPT纳米针的药动学特性，评价其临床应用前景。
本实验中，主要应用到branson超声波振荡仪的实验步骤是将家兔的血浆样品进行处理。
由于血浆样品中含有多种组分，要得到目标样品，就需要先进行血浆样品的分散、混匀，这个步骤做的效果和速度对于后续的步骤存在一定的影响，所以本步骤是实验的不可缺少的。本实验中应用branson超声振荡的时间为5分钟，而一般品牌做的时间大致都在15-30min,branson超声波振荡仪实验效果好、实验速度快，是超声波振荡仪器的优选品牌。
[摘要]
目的：建立家兔血浆中注射用纳米羟基喜树碱含量的HPLC测定方法。方法：血浆样品酸化后，提取分析。色谱柱C18 （10 µm， 250 mm×4.6 mm ID），流动相为 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长384 nm。以5.0 mg/kg剂量给大白兔耳缘静脉推注纳米羟基喜树碱针，于不同时间点采血测定**浓度。结果：羟基喜树碱保留时间为8.7 min，定量线形范围为20-8000 ng/mL。血浆中羟基喜树碱的回收率为96.92%-103.51%，日内精密度 ≤ 7.87%，日间精密度 ≤ 11.55%。纳米羟基喜树碱注射后符合三室模型。结论：本法简便实用，定量准确，可满足纳米羟基喜树碱动力学研究的需要。
[关键词]羟基喜树碱；纳米；高效液相色谱；血药浓度
Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits by HPLC
CHEN Yu-Jun1, YI Yi-Mu2(1. Wuhan medical and health center for women and children, Hubei Wuhan, 430016;2.School of pharmacy, Tongji medical college, Huazhong university of science and technology, Hubei Wuhan,430030)
[Abstract] Objective: To establish a HPLC method for the determination of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits. Methods: After acid treatment, plasma samples were injected and measured by abstraction. The Chromatographic column was C18(10 µm， 250 mm×4.6 mm ID). Methannol-10mmol/L phosphate buffer (pH4.0) (50:50) was served as mobile phase at 1.0 mL/min . Detection wavelength was 384 nm. Determination the concentration of injected-nano-hydroxycamptothecin in plasma of rabbits after iv. administration with the dosage of 5.0 mg/kg. Results: The retention time of hydroxycamptothecin was 8.7 min. A good linearity was shown in the concentration range of 20-8000 ng/mL. The recovery was between 96.92% and 103.51%. The intra-day RSD was less than 7.87% and the inter-day RSD was less than 11.55%. The concentration-time curves of injected-nano-hydroxycamptothecin mainline conformed to three-compartment model. Conclusion: This method was simple, practical and accurate. It could be applied in pharmacokinetic study of nano-hydroxycamptothecin.
[Key words] hydroxycamptothecin; nano; HPLC; drug concentration in plasma
喜树碱(camptothecin,CPT)是从我国特有的珙垌科植物喜树的树千、树皮和果实中提取的一种具有抗肿瘤作用的生物碱，但由于毒性大而限制其临床应用。10-羟基喜树碱(10-hydroxycamptothecin,HCPT)是喜树碱的半合成衍生物，体外和动物实验显示它比CPT的抗肿瘤作用强和抗瘤谱宽且毒性较低。
纳米技术的出现，使保留内酯结构的HCPT进入体内成为可能，为充分发挥其抗肿瘤活性带来希望。本研究将从HCPT纳米针静脉注射后在家兔血浆**浓度随时间变化规律方面考察HCPT纳米针的药动学特性，评价其临床应用前景。
1 仪器、试药与实验动物
1．1 仪器 Lab Alliance高效液相色谱仪（包括 Lab Alliance PC3000HPLCSystem和Model 500型UV检测器），色谱柱为Irregular-HC18柱（10 µm，Φ4.6 mm×250 mm，天津市色谱科技有限公司提供），Heraeus高速离心机（德国），LDZ5-2型低速离心机（北京医用离心机厂），BRANSON 3510型超声振荡仪（美国Branson公司生产）。 1．2 药品、试剂与实验动物 HCPT内酯标准品（批号：20020501，含量：98.6%）和HCPT注射用纳米针（批号：20030501，含量：97.0%）由武汉李时珍药业有限公司提供。甲醇和乙腈为色谱纯（天津市运盛化学试剂科技有限公司），磷酸和其它试剂均为分析纯（天津化学试剂三厂）。日本大耳兔，天津市动物中心提供（实验动物质量合格证号：WJ津实动质R-A准字第001号），雌雄兼用，体重2.5~3.0 kg。
2 测定方法及条件
2．1 色谱条件：色谱柱C18 （10 µm， 250 mm×4.6 mm ID），流动相为 10 mmol/L磷酸盐缓冲溶液（pH4.0）-甲醇（50：50），流速1.0 mL/min，检测波长384 nm，柱温30 ℃。
2．2 血浆样品的采集 ：实验用家兔禁食12小时，于给药后按设计的时间点，经耳缘静脉取血2 mL，置于5 mL肝素化试管，3000 r/min离心10 min，取血浆，-20 ℃冷冻保存。
2．3 血浆样品的处理：精密量取0.5 mL血浆样品于2 mL离心管，加85%磷酸2 µL，室温避光环合2小时以上。环合后的样品加乙腈1 mL，充分混匀，超声振荡5 min，13000 r/min离心10 min。取离心后上清液1.1 mL，置于10 mL离心管，50 ℃水浴，氮气流吹干液体，残渣以80 µL流动相溶解，20 µL进样环进样。
3 分析方法考察结果
3．1 方法专属性
取家兔空白血浆，除不加标准品溶液外，其余按“血浆样品处理”顶下方法处理并分析，获得空白血浆的色谱图，将一定浓度HCPT内酯标准溶掖加入空白血浆中，同法操作，获得相应的色谱图。血浆色谱图中HCPT保留时间为8.7 min，血浆中内源性物质不干扰HCPT的测定。
