摘要：

       寻找超声破碎后高效率提取致龋菌变异链球菌蛋白质的*佳放置时间。方法　以裂解液为提取介质，采用超声法破碎**。对比破碎前、后菌形态并将菌提取液分别放置０ 、１０ 、３０ 、５０ 、７０ min 收集蛋白上清液，通过RC DC 法测定蛋白质浓度及蛋白质SDS‐PAGE 电泳，比较放置不同时间后的蛋白质提取效果。结果　超声破碎后，少部分**破碎不完全。RC DC法测定结果显示，超声破碎后放置３０ min 时提取的蛋白质浓度高于其他各组（P ＜ ０ ．０５） ，但SDS‐PAGE 电泳显示蛋白质的条带分布和丰度无明显差别，推测蛋白质的释放和溶解需要一定时间完成。结论　超声法提取变异链球菌蛋白质后放置３０ min 可显著提高蛋白质提取效率。变异链球菌属于革兰阳性菌，细胞壁厚且坚韧难以破碎，一般采用的破碎方法有反复冻融结合超声法、氧化铝粉末混合研磨法、玻璃珠匀浆法以及高压法等［６‐８］ 。超声波破碎法是目前提取**蛋白时常用的技术手段［９‐１０］ 。Thongboonkerd等［１１］研究认为仅通过超声即可使化脓性链球菌达到８０％ 的破碎，但无明确评价**破碎程度的指标。超声破碎法在大大提高蛋白质提取效果的同时，还能增加蛋白质的溶解性［１２］ ，且可避免外源性蛋白质对样本的污染［１３］ 。已有实验表明超声破碎变链菌效果明显［９ ，１４］ ，而在变链菌蛋白质组研究中，如何提取样本的*大量对结果至关重要。本实验将超声破碎结束的变链菌菌悬液分别放置不同时间，在菌体内的蛋白质充分溢出并溶解后，对其中的蛋白进行构成及量的测定，探索放置时间对菌悬液中蛋白质提取效率的影响。SDS‐PAGE 电泳可根据相对分子质量的不同分离混合蛋白质，是分析各蛋白质构成变化的有效手段［１４］ 。本实验电泳结果显示，超声后放置不同时间的菌悬液中蛋白质的条带分布及丰度基本相同，提示放置时间对菌悬液中蛋白质的构成无明显影响，但对浓度的影响无法通过SDS‐PAEG 电泳**展示。本实验采用的RC DC 试剂盒法以Lowry 法为基础，并能够兼容裂解液中多种试剂成分，同其他蛋白质定量测定方法相比，具有精密度高、准确性好等特点［１５‐１６］ 。定量结果表明，超声破碎后放置３０ min 的菌悬液中蛋白质的浓度*高；放置时间少于３０ min 的菌悬液，随时间的延长蛋白质浓度逐渐升高，而超过３０ min 所提取的蛋白质随时间的延长浓度下降。经扫描电镜观察，大部分**破裂后呈絮状碎片，极小部分**呈现清晰的残余菌体形态，个别变链菌菌体较为完整。提示胞壁破裂完全的**胞内物质已充分外流，蛋白质等内容物的释放较彻底。而形态完整的**胞壁上可能存在有较小的裂口，猜测它们和存在残余菌体的变链菌胞内物质的释放需要一定时间完成。在测定蛋白质质量浓度时，需保证菌体内释放的蛋白质充分溶解于提取介质中。而当蛋白质的释放量少，或出现蛋白降解、沉淀等情况时，即导致提取介质中蛋白质的溶解减少，使测量浓度偏低。本实验采用的提取液中含有的脲和硫脲等可以充分破坏蛋白质之间形成的氢键，防止由氢键引起的蛋白质聚集。还原剂DTT 能够帮助打开蛋白质的二硫键，促进半胱氨酸残基被还原，使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。而蛋白酶抑制剂PMSF 可有效抑制**自身所释放的蛋白酶对蛋白质的降解。由数据可看出，蛋白质质量浓度与裂解后放置时间在０ ～ ３０ min 范围内成正相关。由此提示，一方面，蛋白质的释放可能随时间的延长增加；另一方面，提取介质中复杂的试剂成分与蛋白质、水解酶的相互作用可能并没有伴随裂解过程的结束而终止，而在裂解后的一段时间内继续进行。同时，蛋白酶抑制剂PMSF 主要抑制丝氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，而菌体内释放的其他蛋白酶可能仍存在活性，它们在溶解后与蛋白质相互作用，导致蛋白质浓度的降低。但放置３０ ～ ７０ min 与蛋白质浓度的相关性无明显规律，具体作用机制需进一步探索。